ترجمه مقاله علمی بین المللی درباره بخور جوش شیرین شماره 6

بیکربنات (جوش شیرین) از رشد باکتری و تشکیل بیوفیلم پاتوژنهای فیبروز کیستیک شایع جلوگیری می‌کند

Orsolya Dobay, DOI:10.3389/fmicb.2018.02245, Frontiers in Microbiology

خلاصه

ما اثرات بیکربنات (جوش شیرین) بر رشد چندین باکتری مختلف و همچنین اثرات آن بر تشکیل بیوفیلم و غلظت داخل سلولی cAMP را در سودوموناس آئروژینوزا بررسی کرده ایم. تشکیل بیوفیلم در صفحات سالم 96، با یا بدون بیکربنات (جوش شیرین)بررسی شد. تولید cAMP  باکتریها توسط کیت سنجش تجاری اندازه گیری شد. ما دریافتیم که NaHCO3 (100 میلی مولول-لیتر) به طور قابل توجهی مهار می‌کند، در حالی که کلریدسدیم (100 میلی مولول-لیتر) بر رشد باکتری‌های پلانکتونی تأثیر نمی‌گذارد. اندازه گیری MIC و MBC نشان داد که یون بیکربنات(جوش شیرین) باکتریواستاتیک است و نه ضد باکتری. علاوه‌براین، بیکربنات با غلظتی مناسب از تشکیل بیوفیلم جلوگیری می‌کند. بیکربنات(جوش شیرین) و قلیایی شدن pH خارجی باعث افزایش معناداری در سطح cAMP داخل سلولی می شود. در نتیجه یون بیکربنات (جوش شیرین)مانع رشد پلانکتونی باکتری‌های مختلف و تشکیل بیوفیلم توسط سودومونا آئروژینوزا  شده که با افزایش تولید cAMP داخل سلولی همراه است. این یافته ها نشان می دهد که استنشاق آئروسل با محلول‌های یون بیکربنات (جوش شیرین)ممکن است به بهبود بهداشت تنفسی در بیماران مبتلا به فیبروز کیستیک و احتمالاً سایر بیماری های مزمن ریوی کمک کند.

مقدمه
فیبروز کیستیک (CF) به دلیل جهش در ژن رمزگذاری کننده پروتئین تنظیم کننده هدایت غشایی فیبروز کیستیک (CFTR) ایجاد می‌شود. یک کانال آنیون اپیتلیال وابسته به cAMP/ پروتئین کیناز A  (PKA)  است که هم کلرید و هم بیکربنات (جوش شیرین)را هدایت می کند. انتقال ناقص آنیون ترانس اپیتلیال باعث اختلال در ترشح مخاطی (MCC) شده و منجر به احتباس مخاط غلیظ و چسبناک در مجاری هوایی می شود. پاکسازی ضعیف مخاط چسبناک فیبروز کیستیک به چرخه معیوب انسداد راه هوایی، عفونت و التهاب کمک می کند. با این حال، به نظر می‌رسد که بین نقص اولیه در انتقال آنیون و بیماری فیبروز کیستیک ریه با چند عامل مرتبط است. اخیراً نشان داده شده است که اختلال در ترشح یون بیکربنات (جوش شیرین)احتمالاً عامل تجمع مخاط در فیبروز کیستیک موش و خوک است.

علاوه بر این،pH  پایین غیر طبیعی مایع سطوح راه هوایی (ASL) با کاهش مرگ باکتری در ریه فیبروز کیستیک خوک همراه بود. آئروسل محلول یون بیکربنات(جوش شیرین) روی مجاری هوایی فیبروز کیستیک خوک باعث افزایش مرگ باکتری‌های بالقوه در بدن شد. بکارگیری لنفوسیت‌ها ممکن است ترشح یون بیکربنات(جوش شیرین) اپی تلیال را در هنگام عفونت افزایش داده و به طرز جالب توجهی، این ترشح ممکن است نیاز به CFTR  موجود در لنفوسیت‌ها داشته باشد و این یکی دیگر از کمبودهای موثر بر بیماری فیبروز کیستیک ریه است.

برای چند دهه، یون بیکربنات (جوش شیرین)به عنوان یک ماده مکمل در ضدعفونی کننده‌های میکروبی صنایع غذایی و کشاورزی مورد استفاده قرار گرفته و معرفی شده است. پیش از این، یون بیکربنات (جوش شیرین)همراه با لیدوکائین، به عنوان آنتی‌باکتریال استفاده میشد. از نظر ایمنولوژی، برای فعالیت بهینه پپتیدهای ضد میکروبی بسیار مهم است اما ظاهرا می‌تواند یک اثر آنتی‌باکتریال مستقل بر روی اشریشیا کولی داشته باشد. در پزشکی، این یک درمان پذیرفته شده برای مسمومیت با گاز کلر است و به عنوان یک موکولیتیک و همچنین مدت مدیدی است به عنوان یک مکمل برای رساندن داروی نبولایزر در بهداشت دندان توصیه می‌شود. بیشتر گزارش‌های آنتی‌باکتریال در مورد یون بیکربنات(جوش شیرین) به رشد پلانکتونی محدود شده و شامل تأثیرات شکل‌گیری بیوفیلم نیست.

بیکربنات(جوش شیرین) به طور مستقیم و غیرمستقیم بر عملکرد ریه تأثیر می گذارد. این ماده برای تعیین توالی کلسیم و پروتونها از گرانولهای ترشح شده موکین مورد نیاز است تا امکان انبساط طبیعی در هنگام رهاسازی فراهم شود. همچنین ممکن است بر ظرفیت کشتار نوتروفیل‌ها و کلونیزاسیون باکتری‌ها در ریه ها تأثیر بگذارد. نکته مهم این که یون بیکربنات (جوش شیرین)بر غلظت H+ (pH)  مایع سطوح راه هوایی (ASL) از طریق سیستم بافر HCO3-/ CO2  تأثیر می‌گذارد. این اثرات به طور مستقیم بر خواص ASL و توانایی حیاتی آن در به دام انداختن بقایای استنشاقی و اندوژن برای خروج توسط سطوح مژه‌دار راههای هوایی است. آنها بطور غیرمستقیم با حفظ محیط راه هوایی، ریه‌ها را تحت تأثیر قرار داده، سیستم ایمنی بدن را قادر به پاکسازی عوامل بیماری‌زای ویروسی و باکتریایی می‌کند. انتظار می رود هر حرکتی مثلا افزودن اگزوژن یون بیکربنات (جوش شیرین)که در اینجا پیشنهاد شد، باز بودن راه هوایی را بهبود بخشیده و کمک می‌کند تا عملکرد ریه تقویت شود.

درمان موفقیت‌آمیز ضدمیکروبی برای عفونت‌های باکتریایی ریه برای افزایش امید به زندگی و بهبود کیفیت زندگی بیماران مبتلا به فیبروز کیستیک بسیار مهم است. با این حال، در ریه‌های فیبروز کیستیک، باکتری ها در بیوفیلم‌ها کلونیزه شده و نابودی پاتوژن ها را دشوار می‌کند. همچنین معلوم شده که باکتریهای موجود در بیوفیلم در مقایسه با سلولهای پلانکتونی مقاوم‌تر هستند. تصور می‌شود که تشکیل بیوفیلم تا حد زیادی توسط مولکولهای پیام رسان ثانویه cAMP و c-di-GMP در سلولهای باکتری تنظیم می‌شود. افزایش غلظت داخل سلولی cAMP همراه با کاهش سطح c-di-GMP با تولید فاکتورهای حاد و کاهش تشکیل بیوفیلم همراه است. بر این اساس، یون بیکربنات(جوش شیرین) باعث تحریک محلول آدنیلات سیکلاز (sAC)  و افزایش فعالیت فسفودی استراز که  c-di-GMP را تجزیه می‌کند، می‌شود. نکته قابل توجه این است که HCO3-،CO2 و pH خارجی بر فعالیت محلول آدنیلات سیکلاز و در نتیجه سطح cAMP داخل سلولی که یک علامت مشخصه برای عوامل واگیر سودوموناس آئروژینوزا است، تاثیر گذاشته و زمان تشکیل بیوفیلم باکتریها در عفونت مزمن کاهش می‎یابد. بنابراین سبک زندگی باکتریایی (پلانکتونی در مقابل بیوفیلم)، تا حدی توسط سطح cAMP داخل سلولی دیکته می‌شود.
در این جا، ما به اثرات یون بیکربنات (جوش شیرین)بر رشد پلانکتونی چندین پاتوژن مشترک فیبروز کیستیک پرداخته و ظرفیت تشکیل بیوفیلم را برای دو باکتری شایع سودومونا آئروژینوزا و استافیلوکوک آرئوس در این بیماری بررسی می‌کنیم. این کار پیشنهاد جدیدی را ارائه داده که در آن یون بیکربنات (جوش شیرین)ممکن است از نظر درمانی با افزایش سطح cAMP داخل سلولی از کلونیزاسیون و تشکیل بیوفیلم باکتری‌های مرتبط با فیبروز کیستیک جلوگیری کند. داده‌ها نه تنها تصورات قبلی را تأیید می‌کنند، بلکه دلایل دیگری نیز اضافه کرده تا استنشاق بیکربنات(جوش شیرین) را به عنوان درمان بالقوه خصوصا در زمینه فیبروز کیستیک که نقصان ترشح یون بیکربنات با مشکل اساسی روبرو است، در نظر بگیریم.

مواد و روش‌ها

آزمایشات رشد

رشد  ATCC، سویه‌ها و ایزوله‌های بالینی باکتریهای مختلف گرم مثبت و گرم منفی را در انفوزیون مایع مغزی-قلبی (BHI) کنترل می‌کند. محیط کشت با و بدون 100 میلی‌مول در لیتر یون بیکربنات (جوش شیرین)در محیط کشت مقایسه ​​و با CO2 برای کنترل pH  متعادل گردید. آزمایشات رشد با استفاده از سویه‌های مرجع زیر انجام شد:

S.aureus ATCC25923(MSSA), S.aureus ATCC 29213 (MSSA), S.aureus ATCC 33591 (MRSA), Streptococcus agalactiae ATCC 80200, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E.faecalis, vanB+, ATCC 51299, P.aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, Haemophilus influenzae ATCC 49766, H. influenzae ATCC 49247.

بعضی از آزمایشات با ایزوله‌های کلینیکی همان نژاد، که از نمونه‌های روتین آزمایشگاه تشخيص باکتریولوژیک مرکزی دانشگاه زیملوایز در بوداپست تهیه شده، تکرار شد.

تراکم سوسپانسیونهای باکتریایی در 0.5 مک فارلند (تقریباً 108 CFU ml-1) با دستگاه VITEK Densichek (Biomérieux, Marcy l’Etoile, France) تنظیم شد. PH محیط کشت BHI حاوی100میلی‌مول در لیتر یون بیکربنات(جوش شیرین) تقریبا با  pH 7.4 حباب محلول اتوکلاو تنظیم شد و قبل از تلقیح برای تعادل با 20٪ هوای متعادل CO2 حداقل به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. PH این محلول‌ها در بطری‌های درب دار حداقل برای 24 ساعت پایدار بود. برای دستیابی به مقادیر دیگرpH، غلظت CO2 مورد نیاز از معادله هندرسون- هاسلباخ برای سیستم بافری HCO3-/CO2محاسبه شد. هنگامی که محیط کشت BHI حاوی 100 میلی‌مول در لیتر بیکربنات سدیم(جوش شیرین) که با 5 درصد CO2 بالانس شده بود،pH اندازه گیری شده (5/8∼) تا حدودی بالاتر از مقدار محاسبه شده در معادله هندرسون-هاسبالباخ بود (8 .(∼مقدار هر سوسپانسیون (200 میکرولیتر) در صفحات میکروتیتر 96 قسمتی به صورت تکراری توزیع شد. سپس سوسپانسیونهای باکتریال در هوای محیط (CO2 %04/0∼) در CO2 5 یا 20 درصد بوسیله طراحی چیده شدند. رشد باکتریها با اندازه گیری چگالی نوری (OD) در 595 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت (آزمایشگاه Bio-Rad، هرکول ، کانادا) 60 دقیقه پس از تلقیح و متعاقباً هر 15 دقیقه به مدت 5.5 ساعت پیگیری شد. چگالی نوری از یک کنترل منفی (بدون رشد باکتری) از تمام مقادیر OD جدا شد. نتایج اندازه گیری‌های موازی نمونه‌های تکراری با کنترل واسطه‌ها تعدیل و نرمال شد. نرخ رشد با محاسبه مساحت زیر منحنی (AUC) و استفاده از نرم‌افزار Microsoft Excel، بر اساس جمع‌بندی ذوزنقه‌های کوچک، تعیین شد.

اسمولالیتی محیط BHI مطابق با داده‌های منتشر شده قبلی تقریباً  mosm/kg360 بود. از آنجا كه مكمل محیط کشت BHI  با mmol/l100 بیکربنات سدیم(جوش شیرین)، ميزان اسموليتي محلول تقريباً به mosm/kg 470 افزايش یافت، رشد باكتري نيز در محيط BHI حاوي  mmol/l100 کلرور سدیم (PH 4/7 منطبق با NaOH) به عنوان گروه کنترل اندازه گيري شد. به عنوان کنترل  pHرشد باکتریها در محیط غیرمترقبه BHI تنظیم شده با HCl و NaOH،PH  6.8 تا 9.0 مورد نیاز است.

تعیین حداقل غلظت مهارکننده (MIC) و حداقل غلظت باکتری (MBC)  با رقت کم محیط کشت

برای تعیین MIC و MBC ، دو سویه سودومونا آئروژینوزا ( (ATCC 27853و یک ایزوله بالینی و دو سویه استافیلوکوک آرئوس ( (ATCC 29213و یک ایزوله بالینی انتخاب شدند. باکتریها به مدت 20-18ساعت در صفحات آگار خون کشت داده شدند. روز بعد، یک سوسپانسیون مک فارلند 0.5 در محلول نمک فیزیولوژیکی تهیه شد. این سوسپانسیون به نسبت 1:20 در محیط مولر-هینتون  (MH)جهت تنظیم کاتیون رقیق شد. برای اندازه گیری‌های بیشتر از این تلقیح استاندارد استفاده شد. بیکربنات سدیم (جوش شیرین)به صورت سریالی در محیط MH (تنظیم کاتیون) در یک صفحه پلاستیکی میکرودیلوشن ته‌گرد دو مرتبه تا حجم نهایی 0.1 میلی‌لیتر رقیق شد. غلظت بیکربنات سدیم(جوش شیرین) طی 10 مرحله تا 2 برابر از غلظت‌های  mmol/l 1.95-1000 متغیر بود. منابع با 0.01 میلی‌لیتر از ماده تلقیحی استاندارد آغشته و از کنترل رشد مثبت و منفی نیز استفاده شد. 24 ساعت پس از لقاح، رشد باکتریها بر اساس تغییرات قابل مشاهده کدورت ارزیابی شد. MIC به عنوان کمترین غلظت بیکربنات (جوش شیرین)که در آن هیچ رشد قابل توجهی مشاهده نشد، معرفی شد. برای تعیین MBC ، نمونه‌هایی از منابع بدون رشد باکتریایی قابل مشاهده، بر روی صفحات آگار بدون آنتی بیوتیک تلقیح شده و به مدت 24 ساعت نگهداری شدند. MBC به عنوان کمترین غلظت بیکربناتی که هیچ کلنی در آن مشاهده نشده بود، تعریف شد.

آزمایشات بیوفیلم

اگرچه تقریباً تمام باکتریهای درگیر در بیماری فیبروز کیستیک ریه می‌توانند بیوفیلم تشکیل دهند، سودومونا آئروژینوزا بزرگترین چالش بالینی را نشان می‌دهد. بنابراین، ما سودومونا آئروژینوزا را برای تشکیل بیوفیلم بررسی کردیم. ایزوله‌ها به مدت يك شب تا مرحله ثبوت در محیط کشت حاوي عصاره گوشت 0.3٪، عصاره مخمر 0.2٪، پپتون 1٪، NaCl 0.5٪  که توسط  NaOH روی PH= 7.5 تنظیم شده بود، رشد یافتند. کشت‌های شبانه در محیط مورد نظر به نسبت  1: 100 رقیق شدند. همه محلول‌ها توسط فیلتراسیون و با استفاده از غشای فیلتر 0.22 میکرومتر تهیه شدند. مقادیر یکسان 100 میکرولیتر از کشت‌های رقیق شده به هشت حفره موازی از یک صفحه میکروتیتر 96 حفره‌ای اضافه شدند. صفحات پوشیده شده در دمای 37 درجه سانتیگراد در هوای محیط ، 5٪ یا 20٪ CO2  برای 48 ساعت نگه داشته شدند. سپس باکتریهای پلانکتونی سه بار با شستشوی دقیق با PBS برداشته شدند. باکتریهای حفرات در تماس با هوا خشک شده و متعاقباً با 125 میکرولیتر از محلول کریستالی 0.1 درصد بنفش به مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. بنفشه کریستالی اضافی با آب شستشو و حذف شد. یعنی چندین بار صفحات در آب غرقه شدند. پس از خشک شدن با هوا، بنفشه کریستال در 30٪ اسید استیک (200 میکرولیتر در هر حفره) به مدت 10 دقیقه حل شد. از هر حفره، 125 میکرولیتر از این محلول به حفرات جداگانه یک صفحه 96 حفره‌ای تخته نوری کاملاً واضح منتقل شد. غلظت نور در یک ریدر میکروپلیت PR2100  در 595 نانومتر اندازه گیری شد.

برای اندازه‌گیری تأثیر محتوای گلوکز در تشکیل بیوفیلم، کشت با 0.2 ، 1.0 ، 2.0 و 4.0 گلوکز گرم در لیتر غنی شد. تشکیل بیوفیلم در محتوای گلوکز کم بود و در گلوکز 4.0 گرم در لیتر قویترین بود، در نتیجه تمام آزمایشات در محیط کشت حاوی 4.0 گرم گلوکز در لیتر انجام شد.

اندازه گیری سطح cAMP داخل سلولی

تولید cAMP  باکتری با کیت سنجش حلقوی AMP XP® تعیین شد (فناوری سیگنالینگ سلولی، لیدن، هلند، ابتدا برای سلولهای یوکاریوتی طراحی شده بود، اما برای باکتریها نیز کاربرد دارد). ابتدا کشتهای باکتریایی به مدت 15-16 ساعت در محیط مورد نظر تا مرحله ثبوت برای تهویه رشد داده شدند ، سپس به نسبت 1:500 در10 میلی‌لیتر از همان محیط تازه رقیق شدند و تا رسیدن به مرحله ورود به سیستم ، یعنی OD595= 0/4-0/5 به مدت چند ساعت رشد کردند. سپس کشت‌ها (4000 × گرم ، 5 دقیقه) سانتریفوژ شدند، باکتریها در 200 میکرولیتر از بافر لیز کیت به مدت 30 دقیقه روی یخ مجددا معلق و سانتریفیوژ شدند (8000 × گرم، 5 دقیقه). 50 میکرولیتر از مایع رویی به صفحه سنجش منتقل شد. مطابق پروتکل کیت، میزان جذب در 450 نانومتر در یک دستگاه خواننده میکروپلیت PR2100 اندازه گیری شد.

تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری از ویندوز 7 (Statsoft) استفاده شد. داده‌های ارائه شده به صورتMean ± SD  هستند، در غیر این صورت بیان نشده اند. مقادیر با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون مقایسه مقطعی LSD مقایسه شدند. تغییرات در P <0/05 معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

کاهش رشد باکتری با بیکربنات(جوش شیرین)

از آنجا که گزارش شده غلظت بالای یون بیکربنات(جوش شیرین) خارجی و/ یا PH آلکالین خارجی برای مهار رشد E.coli موثر است، ما اثر یون بیکربنات (جوش شیرین)را بر رشد E.coli آزمایش کردیم. میزان رشد باکتری‌ها در مایع BHI به همراه 100 میلی‌مول در لیتر بیکربنات(جوش شیرین) (pH 7/4 معادل20 درصد CO2) در مقایسه با محیط کنترل (pH 7/4) بدون افزودن بیکربنات (جوش شیرین)به طور قابل توجهی مهار شد. ما رشد باکتری‌ها را در محیط کشتBHI  را با 100 میلی‌مول در لیتر NaCl (PH 7/4 ∼ Δ 110 mosm/kg) که رشد باکتری ها را مهار نمی کند، آزمایش کرده و نشان داد که اثر مهاری بیکربنات (جوش شیرین) به دلیل افزایش اسمولالیته یا قدرت یونی نیست.

بعد، ما آزمایش کردیم که آیا pH قلیایی روی رشد باکتریها تأثیر دارد یا خیر. در محیط کشت BHI  با  pH 8.5، میزان رشد قابل توجهی صورتت نگرفت (شکل 1A). با این حال، هنگامی که باکتری‌ها در محیط BHI با 100 میلی‌مول در لیتر بیکربنات(جوش شیرین) در pH 8.5 (5 CO CO2) نگهداری شدند، اثرات مهاری مشابه موارد مشاهده شده در pH 7.4  (20٪ CO2) (شکل 1A). بنابراین، داده‌ها نشان می‌دهد که بیکربنات(جوش شیرین) به خودی خود رشد باکتری را مهار کرده و  این مساله به دلیل اسمولالیته بالاتر یا محیط قلیایی نبود.

به منظور بررسی اینکه آیا اثر مهاری بیکربنات (جوش شیرین)مختص سلولهای E. coli است، گونه‌های دیگری مانند سودومونا آئروژینوزا، استافیلوکوک آرئوس، اشرشیا فکالیس، استافیلوکوک آگلاکتیا و هموفیلوس آنفولانزا را بررسی کردیم. مشابه اثرات بر روی E. coli، بیکربنات (جوش شیرین)(100 میلی‌مول در لیتر) به طور قابل توجهی رشد همه این گونه ها را مهار کرد که نشان می‌دهد یون بیکربنات(جوش شیرین) می‌تواند رشد باکتریها را بطور کلی سرکوب کند (شکل 1B-F). به منظور مقایسه میزان رشد باکتریها در شرایط مختلف بلحاظ کمی، مقادیر AUC به عنوان معیار کاهش نرخ رشد در محیط غنی شده با یون بیکربنات (جوش شیرین)برای هر گونه باکتری تعیین شد (جدول 1).

در آزمایشات قبلی، برای حفظ pH اولیه محیط کشت نزدیک به 7.4، تمام محلول‌های حاوی بیکربنات(جوش شیرین) با مقادیر CO2  تنظیم شدند. بنابراین، ما این سؤال را پرسیدیم که آیا محیط کشت حاوی یون بیکربنات(جوش شیرین) بدون تنظیم میزان CO2  بر رشد سودومونتا آئروژینوزا تأثیر می‌گذارد یا خیر. با وجود این واقعیت که pH محیط‌های کشت در طول مرحله رشد (به عنوان مثال، شش ساعت اول) به افزایش خود ادامه دادند، تراکم باکتری همانند موارد مشاهده شده در حالتی که میزان CO2  متعادل بود، باقی ماند (شکل 2A,B). هنگامی که باکتریها تا مرحله ثبات رشد کردند (به عنوان مثال 24 ساعت)، افزایش قابل توجه مقادیر OD هم در 25 و هم 100 میلی‌مول در لیتر یون بیکربنات(جوش شیرین)، نشان می‌دهد که یون بیکربنات(جوش شیرین) بیشتر باکتریواستاتیک است تا باکتریوساید. توجه داشته باشید که تراکم کمتر باکتری در 24 ساعت زمانی مشاهده شد که 100 میلی‌مول در لیتر یون بیکربنات (جوش شیرین)وجود داشت، اما باید در نظر داشت که محیط قلیایی بیشتر در سطح CO2 اتمسفر، ممکن است اثر مهاری بر سرعت رشد بگذارد (شکل 2A). با این حال، غلظت یون بیکربنات(جوش شیرین) محیط کشت تا 100 میلی‌مول در لیتر با میزان مناسب CO2 رشد حداکثری باکتری را در 24 ساعت مهار می‌کند، مطرح کننده اثرات باکتریواستاتیک  یون بیکربنات(جوش شیرین) در دوره اولیه مرحله رشد است (شکل 2B). وقتی که آزمایش‌های فوق با استافیلوکوک آرئوس تکرار شد، با توجه به تکرار مشخصات رشد باکتریها، نتایج مشابهی را بدست آوردیم.

تعیین نتایج MIC و MBC

در مورد هر چهار ایزوله آزمایش شده، MIC از 125 میلی‌مول در لیتر بدست آمد. MBC برای دو سویه سودومونا آئروژینوزا 500 میلی‌مول در لیتر بود، ضمن این که دو ایزوله استافیلوکوک آرئوس حتی در بالاترین غلظت تست شده یون بیکربنات(جوش شیرین)(MBC> 1000 mmol/L) زنده ماندند.

بیکربنات (جوش شیرین)تشکیل بیوفیلم سودومونا آئروژینوزا را مهار می‌کند

یکی از شدیدترین عوارض بیماری فیبروز کیستیک ریه، تشکیل بیوفیلم باکتری‌های بیماریزا است که ممکن است به دلیل کاهش سطح یون بیکربنات(جوش شیرین) در راه هوایی ریه کیستیک باشد. بنابراین، ما این سؤال را پرسیدیم که آیا یون بیکربنات (جوش شیرین)می‌تواند علاوه بر رشد پلانکتونی باکتری، تشکیل بیوفیلم را نیز مهار کند. گرسنگی گلوکزی همراه با افزایش سطح cAMP منجر به اختلال در شکل‌گیری بیوفیلم می‌شود، از این رو گلوکز برای تشکیل بیوفیلم بهینه مورد نیاز است. به طور مشابه، داده‌های ما نشان می‌دهد با وجود غلظت بالای باکتریها (OD595= 0.94 ± 0.12, n= 7)، هیچ بیوفیلمی در محیط بدون گلوکز  اضافی، قابل تشخیص نبود (شکل 4). از طرف دیگر، میزان رشد باکتری در محیط کشت حاوی مکمل گلوکز مشابه بوده (OD595= 0.81 ± 0.06, n=7) و تشکیل بیوفیلم قوی مشاهده شد. اگر چه محیط کشت حاوی مکمل گلوکز همراه با 100 میلی‌مول یون بیکربانت، مانع از تشکیل بیوفیلم شده و رشد پلاکتون را نیز به طور قابل توجهی مهار می‌کند (OD595= 0.45± 0.04, n=8). برای نشان دادن کاهش تعداد سلولهای زنده در محیط حاوی یون بیکربنات(جوش شیرین)، شمارش باکتریها 48 ساعت پس از کشت انجام شد. در صورت عدم وجود یون بیکربنات(جوش شیرین)، CFU محاسبه شده در محیط کشت با و بدون گلوکز به ترتیب 2.8 × 10 12 و 4.5 × 10 11  بود. متقابلا، در محیط حاوی 100 میلی‌مول در لیتر یون بیکربانت، میزان CFU برابر با  6.6  × 10 6 بود. علاوه بر این ، 50 میلی‌مول یون بیکربنات (جوش شیرین)به طور نسبی باعث مسدود شدن تشکیل بیوفیلم شده که نشان‌دهنده وابستگی مکانیسم مهاری به غلظت است (شکل 4). هنگامی که کلرید سدیم (100 میلی‌مول در لیتر) جایگزین بیکربنات(جوش شیرین) شد، ظرفیت تشکیل بیوفیلم به طور کامل حفظ گردید.

بیکربنات(جوش شیرین) سطح cAMP داخل سلولی را در باکتری‌ها افزایش می‌دهد

مهار تشکیل بیوفیلم ممکن است با تاثیر یون بیکربنات (جوش شیرین)بر سطح cAMP و c-di-GMP ایجاد شود. بنابراین، ما اثرات یون بیکربنات(جوش شیرین) را در تولید cAMP داخل سلولی سودومونا آئروژینوزا بررسی کردیم. محیط BHI با 25 و 100 میل‌مول در لیتر یون بیکربنات (جوش شیرین)منجر به افزایش قابل توجه و وابسته به غلظت در سطح cAMP شود (شکل  5A). نکته مهم، استفاده از 100 میلی‌مول کلرید سدیم در لیتر بر غلظت Camp تأثیر ندارد (شکل 5A). از آنجا که به خوبی می‌دانیم فعالیت sAC به pH  داخل سلول بستگی دارد، ما اثرات تغییرات pH بین 6.0 و 9.0 را بر روی تولید اردوگاه آزمایش کردیم. در این محدوده pH ، افزایش اندکی در سطحcAMP ، موازی با آلکالیزاسیون مشاهده شد (شکل 5B). توجه داشته باشید، حتی بیشترین افزایش میزان cAMP ناشی از  pH، به طور قابل توجهی پایین‌تر از افزایش ناشی از 100 میلی‌مول یون بیکربنات(جوش شیرین) بود. وقتی آزمایش با استافیلوکوک آرئوس تکرار شد، نتایج مشابهی به دست آمد (شکل 5A). روی هم رفته، داده‌ها نشان می‌دهد که سرکوب بیوفیلم توسط یون بیکربنات(جوش شیرین)، از طریق افزایش تولید cAMP داخل سلولی ممکن می‌شود.

بحث
مطالعات اولیه با استفاده از رده سلولی سروز انسانی (Calu-3) نشان داد که سلول‌های اپیتلیال مجاری هوایی می‌توانند یون بیکربنات (جوش شیرین)را ترشح کنند. اخیراً، ترشح  یون بکیربنات فعال در اپیتلیوم مجاری هوایی کوچک نیز به اثبات رسیده است. به نظر می‌رسد که فقدان ترشح یون بیکربنات(جوش شیرین) با پیامدهای مختلف پاتولوژیکی در مجاری هوایی فیبروز کیستیک مانند تشکیل مخاط ضخیم، کاهش حساسیت میکروبی به پپتیدهای ضد میکروبی و اختلال در کشتن باکتریها همراه است. بنابراین، ممکن است حمل بیکربنات(جوش شیرین) به مجاری هوایی در فیبروز کیستیک به طور بالقوه درمانی باشد. علاوه بر این، جدای از فیبروز کیستیک، کاهش pH (احتمالاً به دلیل کاهش یون بیکربنات) مایع راه هوایی و عفونت‌های باکتریایی مزمن نیز در سایر بیماریهای مزمن راه هوایی مانند COPD تشریح شده است.

تغییر در pH خارجی به اسیدی یا قلیایی، برای باکتریها ایجاد استرس کرده، ممکن است بقا و رشد را تحت تأثیر قرار دهد. در محیط‌های قلیایی، سرعت رشد باکتری‌های نوتروفیل کاهش می‌یابد. سلولهای باکتری E. coli هنگامی که در محیط کشت با pH 7 رشد می کنند، نسبت به زمان کشت با pH 8/7 زمان تولید کوتاهتری دارند. اطلاعات ما نشان می‌دهد که 100 میلی‌مول در لیتر بیکربنات (جوش شیرین)به طور قابل توجهی رشد E. coli را در هر دو محیط با pH 7.4 و 8.5 مهار کرده، اما در صورت عدم وجود یون بیکربنات(جوش شیرین) نه PH قلیایی (حداکثر 8.5) و نه افزایش در اسمولالیته معادل آن (NaCl)، رشد باکتری را مهار نکرده، نشان می‌دهد که بیکربنات (جوش شیرین)به خودی خود نقش مهمی در سرکوب رشد دارد. هنگامی که پروتون‌ها باید از محیط خارج سلولی گرفته شوند، شرایط قلیایی ممکن است pH سیتوزولی باکتری‌ها را تغییر دهد. در شرایط قلیایی، پاک‌کننده‌های پروتون به طور قابل توجهی میزان زنده بودن E. coli را کاهش می‌دهند. این پدیده را می‌توان با تقسیم پاک‌کننده‌های غیرپروتونی داخل سیتوزول توضیح داد که در آنجا پروتئینه شده و pH سیتوزولی را افزایش می‌دهند. برای حفظ هموستاز pH ، باکتری‌ها نیاز به مصرف زیاد ATP و افزایش پلاریزاسیون غشایی دارند. ما حدس می‌زنیم که غلظت بالای یون بیکربنات(جوش شیرین) محیط باعث افزایش شیب ورود یون بیکربنات(جوش شیرین) به داخل سیتوزول باکتریها و افزایش pH داخل سلولی می‌شود. با افزایش رشد باکتریها، مصرف انرژی بیشتر می‌شود. مهمتر این که، نتایج مشابه مشاهده شده با استافیلوکوک آرئوس، سودومونا آئروژینوزا، استافیلوکوک آگالاکتای، اشرشیا فکالیس و هموفیلوس آنفولانزا نشان می‌دهد که در کل، یون بیکربنات ممکن است برای مهار رشد باکتریها استفاده شود.

به دلیل شیوع بالای استافیلوکوک آرئوس و سودومونا آئروژینوزا در بیماران مبتلا به فیبروز کیستیک، این عفونت‌های مزمن ریوی مورد توجه ویژه قرار گرفته‌اند. ما مشاهده کردیم که طی ساعات اولیه، رشد استافیلوکوک آرئوس کاهش یافت، در حالی که سودومونا آئروژینوزا PH محیط را افزایش داد. این داده‌ها نشان می‌دهد که یون بیکربنات(جوش شیرین) به جای تغییرpH ، رشد باکتری را سرکوب می‌کند. مشاهده سودومونا آئروژینوزا در محیط حاوی یون بیکربنات (جوش شیرین)بدون معادل سازی با  CO2، نشان داد با وجود افزایش pH محیط کشت، سرعت رشد مشابه زمانی بود که در تعادل با CO2 بود. افزایش زمان کشت به 24 ساعت به وضوح نشان داد که اثر یون بیکربنات به جای باکتریوساید بودن، باکتریواستاتیک است. علاوه بر این، در صورت عدم وجود CO2،pH  بسیار بالا(> 9.2)  همراه با کاهش میزان رشد روی داد.

عفونتهای مكرر ریه ناشی از کلونیزاسیون طولانی مدت باكتریها به شکل بیوفیلم، تهدید مهمی برای بیماران مبتلا به  فیبروز کیستیک است. نکته مهم این است که بیکربنات سدیم(جوش شیرین)، بیوفیلمهای دهانی را در شرایط آزمایشگاهی مختل می‌کند.  همچنین بیکربنات سدیم (جوش شیرین)در ترکیب با سدیم‌متا‌پریودات و سدیم‌ددسیل‌سولفات تشکیل بیوفیلم‌های سودومونا آئروژینوزا  را سرکوب کرد. ما همچنین این مشاهدات را تأیید کردیم که بیکربنات سدیم (جوش شیرین)در 100 میلی‌مول در لیتر مانع تشکیل بیوفیلم  شده و رشد رشد پلانکتونی باکتری‌ها را مهار می‌کند. از آنجا که استفاده از همان مقدارNaCl  (100 میلی‌مول در لیتر) هیچ تاثیری نداشته و غلظت‌های کمتر بیکربنات سدیم(جوش شیرین) فقط تا حدی مانع تشکیل بیوفیلم می‌شود، نتیجه گرفتیم که در مدل تجربی ما یون بیکربنات، به عنوان تابعی از غلظت، تبدیل باکتری به بیوفیلم را سرکوب می‌کند. این مشاهدات ممکن است از نظر درمانی امیدوار کننده باشد، زیرا داده‌های منتشر نشده ما نشان می‌دهد که در شرایط آزمایشگاهی 100 میلی‌مول در لیتر بیکربنات سدیم(جوش شیرین)، اثرات سمی بر روی سلول های اپیتلیال مجاری هوایی ندارد.

تشکیل بیوفیلم به هماهنگی بین سیگنال‌های cAMP و c-di-GMP  در چندین باکتری نیاز دارد. در سودومونا آئروژینوزا  سطح c-di-GMP، سیگنال‌های مسیر تنظیم‌کننده فاکتور cAMPو فاکتورهای شدت بیماری را که از وضعیت پایدار بیوفیلم حمایت می‌کنند، افزایش داد. از طرف دیگر، cAMP تولید فاکتورهای حاد را تحریک، اما تشکیل بیوفیلم را در وبرویو کلرا مهار می‌کند. به همین ترتیب، یون بیکربنات(جوش شیرین)، بروز ژن شدت بیماری را در وبرویو کلرا فعال می‌کند. در لومن روده، ظاهراً یون بیکربنات (جوش شیرین)القای صفراوی c-di-GMP را که مانع تشکیل بیوفیلم می‌شود، سرکوب می‌کند. بر اساس مشاهدات فوق، ما حدس می‌زنیم که یون بیکربنات (جوش شیرین)باید سطح cAMP باکتریایی را افزایش دهد. در واقع، اطلاعات ما نشان می‌دهد که بیکربنات سدیم، غلظت cAMP داخل سلول را در سودومونا آئروژینوزا و استافیلوکوک آرئوس تحریک می‌کند. اثر تحریکی در حضور غلظت معادل NaCl مشاهده نشد که نشان‌دهنده نقش ویژه بیکربنات(جوش شیرین) است. اما جالب توجه است که تولید cAMP وابسته به pH خارجی در محدوده بین 6 و 9 بود. این نتایج با یافته‌هایی که حاکی از تنظیم SAC توسط سیگنال‌های مختلف محیطی مانند کلسیم و CO2/HCo3/pH است، مطابقت دارد. چن و همکاران (2000) قبلاً نشان دادند که عملکردهای SAC در بسیاری از سیستم‌های بیولوژیکی به عنوان حسگر یون بیکربنات(جوش شیرین) عمل می‌کنند. اخیراً نشان داده شده است که  یون بیکربنات (جوش شیرین)از طریق تحریک SAC در مرجان‌ها باعث افزایش تولید cAMP می‌شود. بنابراین، ما حدس می‌زنیم که کاهش ترشح یون بیکربنات(جوش شیرین) از سلولهای اپیتلیال ریه فیبروز کیستیک منجر به کاهش pH لومن و در نتیجه کاهش سطح تولید cAMP در سلولهای باکتری می‌گردد. سطح پایین cAMP باکتری، تولید فاکتور شدت بیماری را کاهش داده، بنابراین سیستم ایمنی داخلی میزبان هوشیار نشده و این مساله شرایط مطلوب را برای ایجاد بیوفیلم فراهم می‌کند. به موازات این رویدادها، ممکن است غلظت بالای c-di-GMP هم از تشکیل بیوفیلم پشتیبانی کرده، ریشه‌کن کردن باکتری‌ها را از  راه‌های هوایی مشکل کند.

نتیجه

از آنجا که دریافتیم افزایش یون بیکربنات(جوش شیرین) مانع از رشد و شکل گیری بیوفیلم چند پاتوژن و باکتری ریوی می‌شود، انتظار داریم با افزایش یون بیکربنات (جوش شیرین)در راه‌های هوایی امکان عفونت، التهاب و همچنین آسیب بافتی در ریه ها کاهش یابد. ما فرض می‌کنیم که استنشاق نبولایزر بیکربنات (جوش شیرین)می‌تواند در برابر باکتری‌هایی از قبیل سودومونا آئروژینوزا و استافیلوکوک آرئوس که از مهمترین پاتوژن‌های عفونت ریه در فیبروز کیستیک هستند، موثر است. اگرچه استنشاقی درمانی ذاتاً اپیزودیک است و بنابراین غلظت یون بیکربنات (جوش شیرین)در راه‌های هوایی حتماً در فواصل استنشاق از بین می‌رود، اما این درمان ممکن است تنها با تغییرات حاد در ترکیبات سطح مایع با کاهش مکرر رشد باکتری‌ها و افزایش توانایی سیستم ایمنی داخلی یا پاک کردن عفونت، مزایای قابل توجهی داشته باشد. با این حال، باید با درمان‌هایی که ممکن است بر روی میزان cAMP داخل سلولی تأثیر بگذارد، احتیاط کرد زیرا افزایش cAMP ممکن است فاکتورهای بیماریزا را تقویت و منجر به تشدید حاد بیماری در مبتلایان به  فیبروز کیستیک با عفونتهای مزمن باکتریایی شود. به طور معمول، علیرغم نگرانی‌های فزاینده در مورد عوارض جانبی آنتی‌بیوتیک، مبتلایان به فیبروز کیستیک بارها با دوره‌های مختلف آنتی‌بیوتیک درمان می‌شوند. اگرچه اثرات آنتاگونیستی برای اثربخشی توبرامایسین گزارش شده است، اطلاعات اولیه منتشر نشده ما نشان می‌دهد كه كارآیی اریترومایسین و ایمی‌پنم در محیط قلیایی افزایش می‌یابد. براساس این مشاهدات، یون بیکربناتی که به طور مرتب استنشاق می‌شود، ممکن است استفاده از آنتی بیوتیک‌ها را کاهش دهد.

متن و منابع نسخه انگلیسی این مقاله:

**جهت مشاهده تصاویر در ابعاد بزرگتر لطفا بر روی آن کلیک کنید…


نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

برای برقراری امکان تعامل با شما کاربر محترم خواهشمند است شماره همراه خود را در فیلد مربوطه وارد نمایید.شماره موبایل شما در سایت منتشر نخواهد شد.

لطفا جای خالی را با مقدار مناسب پر کنید.حاصل همواره عددی مثبت است. *

دکمه بازگشت به بالا